Estoy diseñando un conjunto de cebadores y estoy leyendo sobre los principios del diseño de cebadores, uno de los cuales es:
GC Clamp: la presencia de bases G o C dentro de las últimas cinco bases desde el extremo de 3 «de los primers (GC clamp) ayuda a promover la unión específica en el extremo de 3» debido a la unión más fuerte de G y bases C. Deben evitarse más de 3 G «so C» s en las últimas 5 bases en el extremo 3 «del cebador.
De aquí .
Mi pregunta es ¿qué tan esencial es tener una pinza GC?
Comentarios
- Si es importante tener G o C, ¿por qué se deben evitar más de 3 G o C?
- @biogirl se deben evitar más G / C porque en un evento de emparejamiento entre los cebadores que no ' no desea que el emparejamiento sea demasiado fuerte. De lo contrario, ' obtendrá muchos dímeros de imprimación. Ben, la sujeción de GC es importante ya que permitirá una unión fuerte en 3 ' que es buena para el alargamiento, pero este no es el parámetro principal a modificar. Hay otros parámetros importantes que manejar (por ejemplo, autocomplementariedad, baja complejidad, etc.).
Respuesta
Es difícil proporcionar una respuesta objetiva. Si tiene una longitud decente y una buena complejidad, incluso una sola terminal 3 «G o C haría. Por supuesto, hay que tener en cuenta la relación GC:AT general del cebador y cosas como la temperatura de recocido.
Aquí «s un enlace a diversas opiniones sobre el tema y tiene esta pepita (a la que me suscribo cuando es posible):
FWIW, mis ofrendas preferidas para los dioses PCR son cebadores con una sola G o C 3 «, FWIW. Parece mantenerlos felices en la mayoría de las fases de la luna.
Respuesta
Ofreceré mi propia descripción (empírica) del diseño de la cartilla. Una pinza GC ayuda en la especificidad del cebado y, por lo tanto, contribuye a la eficiencia general de la reacción de PCR. En el pasado, diseñé (por necesidad) cebadores que tenían demasiada sujeción de GC en el extremo de 3 «y utilicé cebadores sin sujeción de GC. Estas reacciones de PCR se realizaron con éxito, con diferentes niveles de dímero de cebador formación y eficiencia general.
En mi experiencia, la sujeción por GC es buena, pero no es estrictamente necesaria para una buena PCR. Mi regla general es terminar mis cebadores con 2 G / C siempre que sea posible. Si algo va a fallar, normalmente no es el PCR.
Respuesta
GC pinzamiento en 3 «, es decir un solo G o C en el extremo 3 «o un par de G/C dentro del Los últimos 6 pb al final de 3 «del imprimador pueden ayudar a retener el imprimador en la plantilla durante el alargamiento, debido a una unión más fuerte en comparación con A=T. Esto no es obligatorio; es uno de los caracteres del cebador que podría mejorar su reacción de PCR.
Al mismo tiempo, evite una combinación secuencial de GC en los últimos 6 pb lo que puede generar autodímeros.
Ejemplo:
5"-.....GCGC-3" tiene una mayor probabilidad de formación de dímeros que 5"-.........GCCG-3"; en tales casos, aún puede usar la última secuencia de cebador.
Responder
A menos que esté haciendo PCR en algo que sabe que es desafiante, solo use primer3 y no se preocupe.