Kiedy najlepiej jest używać metody Hoechst w porównaniu z DAPI do barwienia jądra? Na papierze wydają się być bardzo podobni. Czy są sytuacje, w których jeden jest wyraźnie lepszy?
Odpowiedź
Barwnik Hoechst 33342 jest podobny do DAPI, ponieważ oba są UV- podekscytowany, niewielkie wiązanie rowków i emituje sygnały proporcjonalne do całkowitej zawartości DNA. Oba są maksymalnie wzbudzone w okolicach 355 nm i emitują około 460 nm. Wymagane jest źródło światła UV, które może uszkodzić komórkę. Jest to jednak ryzyko tylko w przypadku Hoechsta, ponieważ DAPI wymaga utrwalenia i / lub permeabilizacji komórek, co jest niezgodne z życiem. DAPI jest bardziej stabilny, ale Hoechst jest jaśniejszy. Oba ulegają wybielaniu po długim naświetlaniu.
Jest jeszcze jeden nowszy barwnik DNA o nazwie DRAQ5, który rozwiązuje wszystkie problemy, o których wspomniałem wcześniej – jest jasny, dość fotostabilny, można go używać w obrazowaniu żywych komórek, a jego długości fal wzbudzania i emisji znajdują się na dalekim czerwonym końcu widma, co oznacza, że nie jest potrzebne promieniowanie UV. Znalazłem dobrą tabelę porównawczą pod adresem http://www.biostatus.com/product/draq5/live_cell_comparison_chart/ , jeśli jesteś zainteresowany. Nie mam z nimi żadnego związku, sposób, w przeszłości często używałem DRAQ5.
Komentarze
- Przepraszamy, ale ta odpowiedź jest nieprawidłowa: większość mikroskopów ma dedykowane Kanał DAPI i zarówno DAPI, jak i Hoechst mogą być bardzo dobrze używane razem z barwnikami podobnymi do FITC. Ponadto brakuje tutaj głównego punktu: Hoechst może barwić żywe komórki, podczas gdy DAPI może ' t. To jest główny powód, dla którego ludzie wybierają siebie nawzajem. -1 nie za to, ale za reklamę. Nie ' nie sądzę, że to należy tutaj.
- -1: DAPI jest całkowicie kompatybilny z GFP, FITC i Alexa 488. \
- mój zły, zredagowany tak, aby odzwierciedlał rzeczywistość.
- Użyj dapi do utrwalonych komórek, to ' jest bardzo jasne, bardzo specyficzne, da ci znać, jeśli masz zanieczyszczenie mykoplazmą w twojej kulturze, ma dobry okres trwałości i jest ogólnie dość niedrogi. Jeśli musisz wykonać obrazowanie żywych komórek, użyj hoechst i podobnie jak @ user1850479 stwierdził, że istnieje wiele typów, wszystkie są ogólnie mniej toksyczne. Jeśli możesz ' t użyć niebieskiej stainy jądrowej Draqa działa dobrze, to ' jest trochę przyciemniony I ' znalazłem, ale jest w bardzo czerwonym zakresie, ' jest stosunkowo nietoksyczny, nie ma tak dobrego okresu trwałości jak inny, o którym wspomniałem tutaj, również ' jest naprawdę drogie $$$$$$$ !!!!
Odpowiedź
DAPI i Hoechst 33342 (są różne barwniki Hoechst, 33342 jest jednym z najczęściej używanych) mają bardzo podobne charakterystyki widmowe. Chodzi tylko o to, że DAPI jest znacznie lepiej wzbudzane przy 405 nm niż Hoechst. Niektóre mikroskopy i cytometry przepływowe mają obecnie lasery lub diody LED 405 nm zamiast źródeł UV, więc może to mieć znaczenie.
Główna różnica , a głównym powodem wyboru jest to, że Hoechst może być używany do barwienia żywych komórek, ponieważ może przenikać przez błonę komórkową, podczas gdy DAPI nie może” t. DAPI wymaga utrwalonych i permeabilizowanych komórek.
Komentarze
- Czy to oznacza, że plamy Hoechsta są bardziej niebezpieczne dla badacza lub środowiska? Jeśli DAPI może ' t dostać się do żywych komórek, ale Hoechst może, czy istnieją obawy dotyczące mutagenności (podobnej np. do bromku etydyny)?
- Tak, rzeczywiście. Ale Hoechst i DAPI traktujemy w naszym laboratorium w ten sam sposób.
Odpowiedź
Zdaję sobie sprawę, że to starszy temat, ale chciałbym wyjaśnić kilka nieporozumień:
1) DAPI jest zwykle określany jako półtrwały barwnik membranowy ze względu na jego penetrację żywotne błony komórkowe są zależne od stężenia. W niższych stężeniach jest przeważnie wykluczony z żywych komórek, podczas gdy przy wyższych stężeniach barwi komórki żywe i martwe w mniej więcej równym stopniu.
2) Hoechst jest dostępny zarówno w trwałych, jak i nietrwałych odmianach membranowych. Upewnij się, że zamówiłeś właściwy dla swojej aplikacji!
3) Niekoniecznie jest prawdą, że Hoechst jest preferowany dla żywotnych komórek. Hoechst ma bardzo powolną dyfuzję na przykład przez grubą tkankę, więc w zastosowaniach obrazowania in vivo (lub w skrawkach tkanek) DAPI często barwi żywotne komórki znacznie lepiej niż (znacznie cięższy) 33342, ponieważ jest lepiej zdolny do dyfuzji przez tkankę. Jednak w przypadku izolowanych komórek Hoechst 33342 może znacznie szybciej barwić zdolne do życia jądra (sekundy vs. minuty w przypadku DAPI).