Projektuję zestaw starterów i czytam o zasadach projektowania starterów, z których jeden to:
Zacisk GC: Obecność zasad G lub C w ostatnich pięciu zasadach od końca 3 „starterów (zacisk GC) pomaga promować specyficzne wiązanie na końcu 3” ze względu na silniejsze wiązanie G i C. Należy unikać więcej niż 3 G lub C w ostatnich 5 zasadach na 3-calowym końcu startera.
Z tutaj .
Moje pytanie brzmi, jak istotne jest posiadanie zacisku GC?
Komentarze
- Jeśli ważne jest, aby mieć G lub C, dlaczego należy unikać więcej niż 3 G lub C?
- @biogirl należy unikać więcej G / C, ponieważ w zdarzenie parowania między starterami, których ' nie chcesz, aby było zbyt mocne. W przeciwnym razie ' dostaniesz dużo dimerów startera. Ben, zacisk GC jest ważny, ponieważ pozwoli na mocne wiązanie na ' 3, co jest dobre dla wydłużenia, ale nie jest to główny parametr, który należy poprawić. Istnieją inne ważne parametry do obsłużenia (np. Komplementarność siebie, mała złożoność itp.).
Odpowiedź
Trudno jest udzielić obiektywnej odpowiedzi. Jeśli masz przyzwoitą długość i dobrą złożoność, nawet pojedynczy terminal 3 „G lub C wystarczy. Oczywiście należy wziąć pod uwagę ogólny stosunek GC:AT startera i rzeczy takie jak temperatura wyżarzania.
Tutaj „s link do różnych opinii na ten temat i zawiera ten samorodek (który subskrybuję, gdy to możliwe):
FWIW, moją ulubioną ofiarą dla bogów PCR są startery z pojedynczym G lub C 3 „, FWIW. Wydaje się, że uszczęśliwia ich większość faz księżyca.
Odpowiedź
Zaproponuję własne (empiryczne) sprawozdanie z projektowania starterów. Zacisk GC pomaga w specyficzności primingu, a zatem przyczynia się do ogólnej wydajności reakcji PCR. W przeszłości (z konieczności) projektowałem startery, które miały zarówno za dużo zaciskania GC na końcu 3 „, jak i użyłem starterów bez zaciskania GC. Te reakcje PCR były przeprowadzane pomyślnie, z różnymi poziomami dimeru startera tworzenie i ogólna wydajność.
Z mojego doświadczenia wynika, że zaciskanie GC jest przyjemne, ale nie jest ściśle wymagane do dobrego PCR. Moja ogólna zasada jest taka, aby zakończyć moje startery 2 G / C, gdy tylko jest to możliwe. Jeśli coś się nie powiedzie, zwykle nie jest to PCR.
Odpowiedź
GC clampowanie na 3 „, czyli pojedyncza G lub C na końcu 3 „lub kilka G/C w ostatnie 6 pz na 3-calowym końcu podkładu może pomóc w utrzymaniu podkładu na szablonie podczas wydłużania, ze względu na silniejsze wiązanie w porównaniu z A=T. Nie jest to obowiązkowe; jest to jeden ze znaków startera, który może poprawić twoją reakcję PCR.
Jednocześnie unikaj sekwencyjnej kombinacji GC w ostatnich 6 pb co może prowadzić do samo-dimerów.
Przykład:
5"-.....GCGC-3" ma większe prawdopodobieństwo powstania dimeru niż 5"-.........GCCG-3"; w takich przypadkach nadal możesz użyć drugiej sekwencji starterów.
Odpowiedź
Chyba że robisz PCR coś, o czym wiesz, że jest trudne, po prostu użyj primer3 i nie przejmuj się tym.