Estou projetando um conjunto de primers e lendo sobre os princípios do design de primers, um dos quais é:
Clamp GC: A presença de bases G ou C nas últimas cinco bases da extremidade 3 “dos primers (clamp GC) ajuda a promover a ligação específica na extremidade 3” devido à ligação mais forte de G e bases C. Mais de 3 G “s ou C” s devem ser evitados nas últimas 5 bases na extremidade 3 “do primer.
De aqui .
Minha pergunta é o quão essencial é ter um grampo GC?
Comentários
- Se é importante ter G ou C, por que mais de 3 G ou C devem ser evitados?
- @biogirl mais G / C devem ser evitados porque em um evento de emparelhamento entre os primers que você não ' deseja que o emparelhamento seja muito forte. Caso contrário, você ' obterá muitos dímeros de primer. Ben, a fixação por GC é importante, pois permitirá uma ligação forte no 3 ', o que é bom para alongamento, mas este não é o parâmetro principal a ser ajustado. Existem outros parâmetros importantes a serem tratados (por exemplo, autocomplementaridade, baixa complexidade, etc.).
Resposta
É difícil fornecer uma resposta objetiva. Se você tiver um comprimento decente e boa complexidade, mesmo um único terminal 3 “G ou C faria. Claro, é preciso levar em consideração a relação GC:AT geral do primer e coisas como a temperatura de recozimento.
Aqui, “s um link para diversas opiniões sobre o assunto e contém este nugget (que eu assino quando possível):
FWIW, minhas ofertas preferidas aos deuses do PCR são primers com um único G ou C 3 “, FWIW. Parece mantê-los” felizes na maioria das fases da lua.
Resposta
Oferecerei minha própria descrição (empírica) do design de primer. Um grampo GC auxilia na especificidade do priming e, portanto, contribui para a eficiência geral da reação de PCR. No passado, eu (por necessidade) projetei primers que tinham muito clampeamento de GC na extremidade 3 “e usavam primers sem nenhum clampeamento de GC. Essas reações de PCR foram realizadas com sucesso, com diferentes níveis de primer-dímero formação e eficiência geral.
Na minha experiência, GC-clamping é bom, mas não estritamente necessário para uma boa PCR. Minha regra geral é terminar meus primers com 2 G / C sempre que possível. Se algo vai falhar, geralmente não é o PCR.
Resposta
GC clamping em 3 “, que está tendo um único G ou C na extremidade 3 “ou um par de G/C no últimos 6 bp na extremidade 3 “do primer, pode ajudar a reter o primer no molde durante o alongamento, devido à ligação mais forte em comparação com A=T. Isso não é obrigatório; é um dos caracteres do primer que pode melhorar sua reação de PCR.
Ao mesmo tempo, evite uma combinação sequencial de GC nos últimos 6 bp que pode levar a autodímeros.
Exemplo:
5"-.....GCGC-3" tem maior chance de formação de dímeros do que 5"-.........GCCG-3"; em tais casos, você ainda pode usar a última sequência de primer.
Resposta
A menos que esteja fazendo PCR de algo que você sabe ser desafiador, apenas use o primer3 e não se preocupe com isso.