Quando é melhor usar Hoechst vs. DAPI para coloração nuclear? Eles parecem ser muito semelhantes no papel. Existem situações em que um é claramente preferível?
Resposta
O corante Hoechst 33342 é semelhante ao DAPI no sentido de que ambos são UV- excitado, menor ligação ao sulco e emite sinais proporcionais ao conteúdo total de DNA. Ambos são excitados ao máximo em torno de 355 nm e emitem em torno de 460 nm. É necessária uma fonte de luz ultravioleta, que pode danificar a célula. No entanto, este é apenas um risco com a Hoechst, pois o DAPI requer que as células sejam fixadas e / ou permeabilizadas, o que é incompatível com a vida. DAPI é mais estável, mas Hoechst é mais brilhante. Ambos estão sujeitos a foto-branqueamento após longa exposição.
Existe outro corante de DNA mais recente, chamado DRAQ5, que compensa todos os problemas que mencionei antes – é brilhante, bastante fotoestável, pode ser usado na imagem de células vivas, e seus comprimentos de onda de excitação e emissão estão na extremidade vermelha do espectro, o que significa que nenhum UV é necessário. Encontrei um bom gráfico de comparação em http://www.biostatus.com/product/draq5/live_cell_comparison_chart/ se você estiver interessado. Não tenho nenhuma conexão com eles, pelo forma, eu usei muito o DRAQ5 no passado.
Comentários
- Desculpe, mas esta resposta está errada: a maioria dos microscópios tem um O canal DAPI e ambos DAPI e Hoechst podem muito bem ser usados em conjunto com corantes do tipo FITC. Além disso, você não percebeu o ponto principal aqui: a Hoechst pode corar células vivas, enquanto o DAPI pode ' t. Esta é a principal razão pela qual as pessoas escolhem umas às outras. -1 não por isso, mas pelo anúncio. Eu não ' acho que isso não pertence aqui.
- -1: DAPI é absolutamente compatível com GFP, FITC e Alexa 488. \
- meu mal, editado para refletir a realidade.
- Use dapi para células fixas, ele ' é muito brilhante, muito específico, permitirá que você saiba se você tem contaminação por micoplasma em sua cultura, tem uma boa vida útil e geralmente é bem barato. Se você tiver que fazer imagens de células vivas, use hoechst e, como @ user1850479, afirmou que existem vários tipos, todos eles geralmente são menos tóxicos. Se você não puder ' usar uma staine nuclear azul Draq funcionar bem, ela ' ficará um pouco fraca I ' descobrimos, mas está na faixa vermelha, ' é relativamente não / tóxico, não tem uma vida útil tão boa quanto a outra que mencionei aqui, também ' é muito caro $$$$$$$ !!!!
Resposta
DAPI e Hoechst 33342 (existem diferentes corantes Hoechst, 33342 é um dos mais comumente usados) têm características espectrais muito semelhantes. O único ponto é que DAPI é muito melhor excitado em 405 nm do que Hoechst. Alguns microscópios e citômetros de fluxo hoje em dia têm lasers ou LEDs de 405 nm em vez de fontes de UV, então isso pode se tornar relevante.
A principal diferença e a principal razão para escolher qualquer um é que Hoechst pode ser usado para corar células vivas, visto que pode passar pela membrana celular, enquanto DAPI não pode” t. DAPI requer células fixas e permeabilizadas.
Comentários
- Isso significa que as manchas Hoechst são mais perigosas para o pesquisador ou para o ambiente? Se o DAPI puder ' t entrar em células vivas, mas a Hoechst pode, há preocupações sobre mutagenicidade (semelhante a, por exemplo, brometo de etídio)?
- Sim, de fato. Mas tratamos Hoechst e DAPI da mesma forma em nosso laboratório.
Resposta
Sei que este é um tópico antigo, mas gostaria de esclarecer alguns equívocos:
1) DAPI é geralmente referido como um corante semimembrana permanente porque sua penetração através as membranas celulares viáveis dependem da concentração. Em concentrações mais baixas, ele é excluído principalmente das células viáveis, enquanto em concentrações mais altas ele cora as células vivas e mortas da mesma forma.
2) Hoechst vem em variedades de membrana permanente e impermanente. Certifique-se de solicitar o correto para seu aplicativo!
3) Não é necessariamente verdade que a Hoechst é preferida para células viáveis. Hoechst tem difusão muito lenta através de tecido espesso, por exemplo, para aplicações de imagem in vivo (ou em seções de tecido), DAPI frequentemente cora células viáveis muito melhor do que o (muito mais pesado) 33342 porque é mais capaz de se difundir através do tecido. Para células isoladas, no entanto, Hoechst 33342 pode corar núcleos viáveis muito mais rapidamente (segundos vs. minutos para DAPI).