Ich entwerfe eine Reihe von Primern und lese über die Prinzipien des Primerdesigns. Eines davon ist:
GC-Klemme: Das Vorhandensein von G- oder C-Basen in den letzten fünf Basen vom 3 „-Ende der Primer (GC-Klemme) fördert die spezifische Bindung am 3“ -Ende aufgrund der stärkeren Bindung von G. und C-Basen. Mehr als 3 G „oder C“ sollten in den letzten 5 Basen am 3 „-Ende des Primers vermieden werden.
Von hier .
Meine Frage ist, wie wichtig es ist, eine GC-Klemme zu haben?
Kommentare
- Wenn es wichtig ist, G oder C zu haben, warum sollten mehr als 3 G oder C vermieden werden?
- @biogirl mehr G / C sollte vermieden werden, weil in Ein Ereignis der Paarung zwischen den Primern, die Sie ' nicht möchten, dass die Paarung zu stark ist. Andernfalls erhalten Sie ' viele Primer-Dimere. Ben, GC-Klemmung ist wichtig, da sie eine starke Bindung an der 3 ' ermöglicht, was gut für die Dehnung ist, aber dies ist nicht der primäre Parameter, der angepasst werden muss. Es sind andere wichtige Parameter zu behandeln (z. B. Selbstkomplementarität, geringe Komplexität usw.).
Antwort
Es ist schwierig, eine objektive Antwort zu geben. Wenn Sie eine anständige Länge und eine gute Komplexität haben, kann sogar ein einzelnes Terminal 3 „G oder C würde tun. Natürlich muss man das GC:AT -Verhältnis des Primers und Dinge wie die Glühtemperatur berücksichtigen.
Hier „s ein Link zu verschiedenen Meinungen zu diesem Thema und es enthält dieses Nugget (das ich nach Möglichkeit abonniere):
FWIW, meine bevorzugten Angebote für die PCR-Götter sind Primer mit einem einzelnen G oder C 3 „, FWIW. Scheint sie in den meisten Mondphasen glücklich zu machen.
Antwort
Ich werde meinen eigenen (empirischen) Bericht über das Primerdesign anbieten. Eine GC-Klemme unterstützt die Spezifität des Primings und trägt daher zur Gesamteffizienz der PCR-Reaktion bei. In der Vergangenheit habe ich (aus Notwendigkeit) Primer entworfen, die sowohl zu viel GC-Klemmung am 3 „-Ende aufwiesen, als auch Primer ohne GC-Klemmung verwendet. Diese PCR-Reaktionen wurden erfolgreich mit unterschiedlichen Primer-Dimer-Spiegeln durchgeführt Bildung und Gesamteffizienz.
Nach meiner Erfahrung ist GC-Clamping nett, aber für eine gute PCR nicht unbedingt erforderlich. Meine allgemeine Faustregel lautet, meine Primer nach Möglichkeit mit 2 G / C zu terminieren. Wenn etwas fehlschlägt, ist es normalerweise nicht die PCR.
Antwort
GC-Klemmung bei 3 “ eine einzelne G oder C am 3 „-Ende oder ein paar G/C innerhalb der Die letzten 6 bp am 3 „-Ende des Primers können dazu beitragen, den Primer während der Dehnung auf der Matrize zu halten, da die Bindung im Vergleich zu A=T stärker ist. Dies ist nicht obligatorisch; Dies ist eines der Merkmale des Primers, das Ihre PCR-Reaktion verbessern kann.
Vermeiden Sie gleichzeitig eine sequentielle Kombination von GC in den letzten 6 bp Dies kann zu Selbstdimeren führen.
Beispiel:
5"-.....GCGC-3" hat eine höhere Wahrscheinlichkeit der Dimerbildung als 5"-.........GCCG-3"
Antwort
Es sei denn, Sie PCRen etwas, von dem Sie wissen, dass es es ist Verwenden Sie einfach primer3 und machen Sie sich keine Sorgen.