Navrhuji sadu primerů a čtu o principech návrhu primerů, z nichž jeden je:
GC Clamp: Přítomnost bází G nebo C v posledních pěti bázích od 3 „konce primerů (GC clamp) pomáhá podporovat specifické vázání na 3“ konci díky silnější vazbě G a báze C. V posledních 5 bázích na 3 „konci primeru je třeba se vyhnout více než 3 G nebo C.
Z zde .
Moje otázka je, jak zásadní je mít GC clamp?
Komentáře
- Pokud je důležité mít G nebo C, proč je třeba se vyhnout více než 3 G nebo C?
- @biogirl je třeba se vyhnout více G / C, protože v událost párování mezi primery, které ' nechcete, aby párování bylo příliš silné. Jinak ' získáte spoustu dimerů primerů. Ben, upnutí GC je důležité, protože umožní silné spojení na 3 ', což je dobré pro prodloužení, ale toto není primární parametr, který je třeba vylepšit. Je třeba se zabývat dalšími důležitými parametry (např. Vlastní komplementarita, nízká složitost atd.).
Odpověď
Je těžké poskytnout objektivní odpověď. Máte-li slušnou délku a dobrou složitost, dokonce i jeden terminál 3 „G nebo C udělá. Samozřejmě je třeba vzít v úvahu celkový GC:AT poměr primeru a věci jako teplota žíhání.
Tady je odkaz na různé názory na dané téma a má tento nugget (k němuž se přihlásím, pokud je to možné):
FWIW, mými preferovanými nabídkami bohům PCR jsou primery s jediným G nebo C 3 „, FWIW. Zdá se, že je“ udrží v šťastné většině fází měsíce.
Odpověď
Navrhnu svůj vlastní (empirický) popis návrhu primeru. GC-svorka pomáhá ve specifičnosti primingu, a proto přispívá k celkové účinnosti PCR reakce. V minulosti jsem (z nutnosti) navrhl primery, které měly jak příliš mnoho GC-upnutí na 3 „konci, tak i primery bez jakéhokoli GC-upnutí. Tyto PCR reakce byly úspěšně provedeny s různými úrovněmi primer-dimeru formace a celková účinnost.
Podle mých zkušeností je GC-clamping pěkný, ale není nutně vyžadován pro dobrou PCR. Mým obecným pravidlem je ukončit mé primery 2 G / C, kdykoli je to možné. Pokud něco selže, obvykle to není PCR.
Odpověď
GC upnutí na 3 „, které má jeden G nebo C na konci 3 „nebo několik G/C v rámci posledních 6 bp na 3 „konci primeru, může pomoci udržet primer na templátu během prodloužení kvůli silnější vazbě ve srovnání s A=T. To není povinné; je to jeden ze znaků primeru, který by mohl zlepšit vaši PCR reakci.
Zároveň se vyhněte postupné kombinaci GC za posledních 6 bp což může vést k automatickým dimerům.
Příklad:
5"-.....GCGC-3" má větší šanci na vytvoření dimeru než 5"-.........GCCG-3"; v takových případech můžete stále použít druhou sekvenci primerů.
Odpovědět
Pokud nepracujete s PCR, o které víte, že je náročné, stačí použít primer3 a nemusíte si s tím dělat starosti.