Olen suunnitellut alukesarjan ja lukenut alukesuunnittelun periaatteet, joista yksi on:
GC-puristin: G- tai C-emästen läsnäolo viiden viimeisen emäksen alukkeiden 3 ”päädystä (GC-puristin) auttaa edistämään spesifistä sitoutumista 3”: n päässä G: n vahvemman sitoutumisen vuoksi ja C-emäkset. Yli 3 G: n tai C: n käyttöä tulisi välttää viiden viimeisen emäksen yhteydessä alukkeen 3 ”-päässä.
täältä .
Kysymykseni on, kuinka tärkeää on saada GC-kiinnike?
Kommentit
- Jos on tärkeää, että sinulla on G tai C, miksi yli 3 G: tä tai C: tä tulisi välttää?
- @biogirl enemmän G / C: tä tulisi välttää, koska pariliitoksen tapahtuma alukkeiden välillä, joita et halua ' halua, että pariliitos on liian vahva. Muussa tapauksessa saat ' paljon alukedimeerejä. Ben, GC-kiinnitys on tärkeää, koska se sallii vahvan kiinnittymisen 3 ': ssä, mikä on hyvä venymiselle, mutta tämä ei ole ensisijainen muutettava parametri. On muitakin tärkeitä käsiteltäviä parametreja (esimerkiksi itsensä täydentävyys, monimutkaisuus jne.).
Vastaa
Objektiivista vastausta on vaikea antaa. Jos sinulla on kohtuullinen pituus ja monimutkaisuus, jopa yksi pääte 3 ”G tai C tekisi. Tietenkin on otettava huomioon alukkeen yleinen GC:AT -suhde ja esimerkiksi hehkutuslämpötila.
Tässä ”s linkki erilaisiin mielipiteisiin aiheesta, ja sillä on tämä kynnys (jonka tilaan aina kun mahdollista):
FWIW, suosittelemani tarjoukset PCR-jumalille ovat alukkeita, joissa on yksi G tai C 3, FWIW. Näyttää pitävän heitä onnellisina useimmissa kuun vaiheissa.
vastaus
Tarjoan oman (empiirisen) tilini pohjamaalin suunnittelusta. GC-puristin auttaa pohjustuksen spesifisyydessä ja edistää siten PCR-reaktion yleistä tehokkuutta. Aiemmin olen suunnitellut (välttämättömyydestä) alukkeita, joissa oli sekä liikaa GC-kiinnityksiä 3 ”-päässä, että käytin alukkeita ilman mitään GC-kiinnitystä. Nämä PCR-reaktiot suoritettiin onnistuneesti, eri alukedimeeritasoilla muodostuminen ja yleinen tehokkuus.
Kokemukseni mukaan GC-kiinnitys on mukavaa, mutta sitä ei välttämättä vaadita hyvälle PCR: lle. Yleinen nyrkkisääntönä on lopettaa alukkeet 2 G / C: llä aina kun mahdollista. Jos jokin epäonnistuu, se ei yleensä ole PCR.
Vastaa
GC-kiinnitys 3 ”: lla, joka on yksi G tai C 3 ”päässä tai pari G/C viimeiset 6 bp alukkeen 3 ”päässä voivat auttaa pitämään alukkeen templaatissa venymän aikana, koska vahvempi sitoutuminen verrattuna A=T: iin. Tämä ei ole pakollista. se on yksi alukkeen hahmoista, joka saattaa parantaa PCR-reaktiotasi.
Vältä samalla GC: n peräkkäistä yhdistelmää viimeisen 6 bp: n kohdalla mikä saattaa johtaa itsedimeereihin.
Esimerkki:
5"-.....GCGC-3" on suurempi mahdollisuus dimeerin muodostumiseen kuin 5"-.........GCCG-3"; tällaisissa tapauksissa voit silti käyttää jälkimmäistä alukesarjaa.
Vastaa
Ellet ole PCR-tietokonetta, jonka tiedät olevan haastava, käytä vain primer3: ta ja älä huoli siitä.