Sto progettando una serie di primer e leggendo i principi del design dei primer, uno dei quali è:
GC Clamp: la presenza di basi G o C nelle ultime cinque basi dallestremità da 3 “dei primer (clamp GC) aiuta a promuovere il legame specifico allestremità da 3” a causa del legame più forte di G e basi C. Si dovrebbero evitare più di 3 G “so C” nelle ultime 5 basi allestremità 3 “del primer.
Da qui .
La mia domanda è quanto sia essenziale avere un morsetto GC?
Commenti
- Se è importante avere G o C perché dovrebbero essere evitati più di 3 G o C?
- @biogirl più G / C dovrebbero essere evitati perché in un evento di accoppiamento tra i primer che non ' vuoi che laccoppiamento sia troppo forte. Altrimenti ' otterrai molti dimeri primer. Ben, il bloccaggio GC è importante in quanto consentirà un forte legame al 3 ' che è buono per lallungamento ma questo non è il parametro principale da modificare. Ci sono altri parametri importanti da gestire (ad es. Auto complementarità, bassa complessità ecc.).
Risposta
È difficile fornire una risposta obiettiva. Se hai una lunghezza decente e una buona complessità, anche un singolo terminale 3 “G o C andrebbe bene. Ovviamente, si deve prendere in considerazione il rapporto GC:AT del primer e cose come la temperatura di ricottura.
Qui “s un link a diverse opinioni sullargomento e contiene questo nugget (a cui mi abbono quando possibile):
FWIW, le mie offerte preferite agli dei della PCR sono i primer con un singolo G o C 3 “, FWIW. Sembra che li mantenga felici per la maggior parte delle fasi lunari.
Risposta
Offrirò il mio resoconto (empirico) del design dei primer. Un GC-clamp aiuta nella specificità del priming e quindi contribuisce allefficienza complessiva della reazione PCR. In passato, ho progettato (per necessità) primer che avevano sia troppo clamping GC allestremità da 3 “e primer utilizzati senza alcun clamping GC. Queste reazioni PCR sono state eseguite con successo, con diversi livelli di primer-dimer formazione ed efficienza complessiva.
Nella mia esperienza, il clamping GC è buono, ma non strettamente richiesto per una buona PCR. La mia regola pratica generale è terminare i miei primer con 2 G / C ove possibile. Se qualcosa fallisce, di solito non è la PCR.
Risposta
GC clamping a 3 “, che sta avendo un singolo G o C allestremità 3 “o un paio di G/C allinterno del ultimi 6 bp allestremità di 3 “del primer, possono aiutare a trattenere il primer sul modello durante lallungamento, grazie al legame più forte rispetto a A=T. Questo non è obbligatorio; è uno dei caratteri del primer che potrebbe migliorare la tua reazione PCR.
Allo stesso tempo, evita una combinazione sequenziale di GC negli ultimi 6 bp che potrebbe portare ad auto-dimeri.
Esempio:
5"-.....GCGC-3" ha maggiori probabilità di formazione di dimeri rispetto a 5"-.........GCCG-3"; in questi casi puoi ancora usare la seconda sequenza di primer.
Risposta
A meno che tu non stia PCRing qualcosa che sai essere impegnativo, usa solo primer3 e non preoccuparti.