Når er det best å bruke Hoechst vs. DAPI til atomfarging? De ser ut til å være veldig like på papir. Er det situasjoner der man klart foretrekker?
Svar
Hoechst 33342-fargestoffet ligner DAPI ved at begge er UV- glade, mindre sporbinding og avgir signaler proporsjonalt med totalt DNA-innhold. Begge er maksimalt begeistret rundt 355 nm og avgir rundt 460 nm. En UV-lyskilde er nødvendig, noe som kan skade cellen. Dette er imidlertid bare en risiko med Hoechst, da DAPI krever at cellene er fikserte og / eller permeabiliserte, noe som er uforenlig med livet. DAPI er mer stabil, men Hoechst er lysere. Begge er gjenstand for fotobleking etter lang eksponering.
Det er et annet nyere DNA-fargestoff som heter DRAQ5 som kompenserer for alle problemene jeg nevnte tidligere – det er lyst, ganske fotostabilt, kan brukes i levende cellebilder, og dens eksitasjon og utslippsbølgelengder er i den ytterste røde enden av spekteret, noe som betyr at det ikke er behov for UV. Jeg fant et godt sammenligningskart på http://www.biostatus.com/product/draq5/live_cell_comparison_chart/ hvis du er interessert. Jeg har ingen tilknytning til dem, av måte, jeg har nettopp brukt DRAQ5 mye tidligere.
Kommentarer
- Beklager, men dette svaret er feil: De fleste mikroskoper har en dedikert DAPI-kanal og både DAPI og Hoechst kan veldig godt brukes sammen med FITC-lignende fargestoffer. Du mangler også hovedpoenget her: Hoechst kan flekker levende celler, mens DAPI kan ' t. Dette er hovedårsaken til at folk velger hverandre fremfor hverandre. -1 ikke for det, men for annonsen. Jeg tror ikke ' dette hører hjemme her.
- -1: DAPI er helt kompatibel med GFP, FITC og Alexa 488. \
- min dårlige, redigert for å gjenspeile virkeligheten.
- Bruk dapi for faste celler, det ' er veldig lyst, veldig spesifikt, vil gi deg beskjed hvis du har mycoplasma-forurensning i din kultur, har god holdbarhet og er generelt ganske billig. Hvis du må gjøre levende cellebilder, bruk hoechst og som @ user1850479 sa at det er flere typer, er de generelt sett mindre giftige. Hvis du kan ' ikke bruke en blå kjernefysisk stain Draq fungerer bra, fungerer det ' litt svakt jeg ' har funnet, men den er i langt rødt område, den ' er relativt ikke / giftig, har ikke så god holdbarhet som den andre jeg nevnte her, også den ' er veldig dyrt $$$$$$$ !!!!
Svar
DAPI og Hoechst 33342 (det er forskjellige Hoechst-fargestoffer, 33342 er en av de mest brukte) har veldig like spektrale egenskaper. Det eneste poenget er at DAPI er mye bedre begeistret ved 405 nm enn Hoechst. Noen mikroskoper og strømningscytometre har i dag 405 nm lasere eller lysdioder i stedet for UV-kilder, så dette kan bli aktuelt.
Hovedforskjellen og den viktigste grunnen til å velge en av disse er at Hoechst kan brukes til å plette levende celler da den kan passere cellemembranen, mens DAPI ikke kan» t. DAPI krever faste og permeabiliserte celler.
Kommentarer
- Betyr dette at Hoechst-flekker er mer farlige for forskeren eller miljøet? Hvis DAPI kan ' t kommer inn i levende celler, men Hoechst kan, er det bekymringer for mutagenisitet (ligner f.eks. etidiumbromid)?
- Ja, faktisk. Men vi behandler Hoechst og DAPI på samme måte i laboratoriet vårt.
Svar
Jeg er klar over at dette er et eldre tema, men jeg vil avklare noen misforståelser:
1) DAPI blir vanligvis referert til som et semi-membran-permanent fargestoff fordi det trenger gjennom levedyktige cellemembraner er konsentrasjonsavhengig. Ved lavere konsentrasjoner er det stort sett ekskludert fra levedyktige celler, mens det ved høyere konsentrasjoner flekker levende og døde celler omtrent likt.
2) Hoechst kommer i både membranpermanente og impermanente varianter. Sørg for at du bestiller riktig for søknaden din!
3) Det er ikke nødvendigvis sant at Hoechst er foretrukket for levedyktige celler. Hoechst har for eksempel veldig langsom diffusjon gjennom tykt vev, så for in vivo-bildebehandling (eller i vevssnitt) flekker DAPI ofte levedyktige celler mye bedre enn (mye tyngre) 33342 fordi den er bedre i stand til å diffundere gjennom vev. For isolerte celler kan Hoechst 33342 imidlertid mye raskere farge levedyktige kjerner (sekunder mot minutter for DAPI).