Jeg designer et sett med primere og leser om prinsippene for primer design, hvorav den ene er:
GC-klemme: Tilstedeværelsen av G- eller C-baser i de siste fem basene fra 3 «-enden av primere (GC-klemme) bidrar til å fremme spesifikk binding i 3» -enden på grunn av sterkere binding av G og C-baser. Mer enn 3 G eller C bør unngås i de siste 5 basene i 3 «-enden av primeren.
Fra her .
Spørsmålet mitt er hvor viktig det er å ha en GC-klemme?
Kommentarer
- Hvis det er viktig å ha G eller C, hvorfor bør mer enn 3 G eller C unngås?
- @biogirl mer G / C bør unngås fordi i en hendelse med sammenkobling mellom primerne du ikke vil ' t vil at sammenkoblingen skal være for sterk. Ellers får du ' mange primerdimerer. Ben, GC-klemming er viktig, da det vil tillate sterk binding ved 3 ' som er bra for forlengelse, men dette er ikke den primære parameteren som skal justeres. Det er andre viktige parametere å håndtere (for eksempel selvkomplementaritet, lav kompleksitet osv.).
Svar
Det er vanskelig å gi et objektivt svar. Hvis du har en anstendig lengde og god kompleksitet, kan til og med en enkelt terminal 3 «G eller C ville gjort. Selvfølgelig må man ta hensyn til primerens totale GC:AT forhold og ting som glødetemperatur.
Her «s en lenke til ulike meninger om emnet, og den har denne klumpen (som jeg abonnerer på når det er mulig):
FWIW, mine foretrukne tilbud til PCR-gudene er primere med en enkelt G eller C 3 «, FWIW. Ser ut til å holde dem lykkelig de fleste faser av månen.
Svar
Jeg vil tilby min egen (empiriske) beretning om primer design. En GC-klemme hjelper i spesifikasjonen av grunning og bidrar derfor til den totale effektiviteten til PCR-reaksjonen. Tidligere har jeg (av nødvendighet) designet primere som både hadde for mye GC-klemming i 3 «enden, og brukt primere uten GC-klemming. Disse PCR-reaksjonene ble utført med suksess, med forskjellige nivåer av primer-dimer dannelse og generell effektivitet.
Etter min erfaring er GC-klemming fin, men ikke strengt tatt nødvendig for god PCR. Min generelle tommelfingerregel er å avslutte mine primere med 2 G / C der det er mulig. Hvis noe kommer til å mislykkes, er det vanligvis ikke PCR.
Svar
GC-klemming ved 3 «, som har en enkelt G eller C på 3 «-enden eller et par G/C i siste 6 bp ved 3 «enden av grunning, kan bidra til å beholde grunning på malen under forlengelse, på grunn av sterkere binding i forhold til A=T. Dette er ikke obligatorisk; det er et av tegnene i primeren som kan forbedre PCR-reaksjonen din.
Samtidig, unngå en sekvensiell kombinasjon av GC i de siste 6 bp som kan føre til selvdimerer.
Eksempel:
5"-.....GCGC-3" har større sjanse for dimerdannelse enn 5"-.........GCCG-3"; i slike tilfeller kan du fremdeles bruke den siste primersekvensen.
Svar
Med mindre du PCRing noe du vet å være utfordrende, bare bruk primer3 og ikke bekymre deg for det.