Ik “ben een set primers aan het ontwerpen en lees over de principes van primerontwerp, waarvan er één is:
GC-klem: de aanwezigheid van G- of C-basen in de laatste vijf basen van het 3 “-uiteinde van primers (GC-klem) helpt bij het bevorderen van specifieke binding aan het 3” -uiteinde dankzij de sterkere binding van G en C-basen. Meer dan 3 G-‘s of C’ s moeten worden vermeden in de laatste 5 basen aan het 3 ‘uiteinde van de primer.
Van hier .
Mijn vraag is hoe essentieel het is om een GC-klem te hebben?
Opmerkingen
- Als het belangrijk is om G of C te hebben, waarom zou dan meer dan 3 G of C moeten worden vermeden?
- @biogirl zou meer G / C moeten worden vermeden omdat in een gebeurtenis van koppeling tussen de primers die u niet ' wilt, wilt dat de koppeling te sterk is. Anders krijg je ' veel primerdimeren. Ben, GC-klemming is belangrijk omdat het een sterke hechting mogelijk maakt bij de 3 ' die goed is voor verlenging, maar dit is niet de primaire parameter die moet worden aangepast. Er zijn andere belangrijke parameters om mee om te gaan (bijvoorbeeld zelfcomplementariteit, lage complexiteit enz.).
Antwoord
Het is moeilijk om een objectief antwoord te geven. Als je een behoorlijke lengte en een goede complexiteit hebt, kan zelfs een enkele terminal 3 “G of C zou doen. Natuurlijk moet men rekening houden met de algemene GC:AT ratio van de primer en zaken als de uitgloeitemperatuur.
Hier “s een link naar verschillende meningen over het onderwerp en het heeft dit goudklompje (waarop ik me indien mogelijk abonneer):
FWIW, mijn favoriete offers aan de PCR-goden zijn primers met een enkele G of C 3 “, FWIW. Het lijkt erop dat ze de meeste fasen van de maan gelukkig houden.
Antwoord
Ik zal mijn eigen (empirische) uiteenzetting geven van primerontwerp. Een GC-klem helpt bij de specificiteit van de priming en draagt daarom bij aan de algehele efficiëntie van de PCR-reactie. In het verleden heb ik (noodgedwongen) primers ontworpen die zowel teveel GC-klemming hadden op het 3 “uiteinde, als primers zonder GC-klemming. Deze PCR-reacties werden met succes uitgevoerd, met verschillende niveaus van primer-dimeer formatie en algehele efficiëntie.
In mijn ervaring is GC-klemmen leuk, maar niet strikt vereist voor een goede PCR. Mijn algemene vuistregel is om mijn primers waar mogelijk te beëindigen met 2 G / C. Als er iets gaat mislukken, is het meestal niet de PCR.
Antwoord
GC-klem bij 3 “, dat wil zeggen een enkele G of C aan het 3 “uiteinde of een paar G/C binnen de laatste 6 bp aan 3 “uiteinde van de primer, kan helpen om de primer op het sjabloon te behouden tijdens verlenging, vanwege een sterkere hechting vergeleken met A=T. Dit is niet verplicht; het is een van de karakters van de primer die uw PCR-reactie zou kunnen verbeteren.
Vermijd tegelijkertijd een opeenvolgende combinatie van GC in de laatste 6 bp wat zou kunnen leiden tot zelfdimeren.
Voorbeeld:
5"-.....GCGC-3" heeft een grotere kans op dimeervorming dan 5"-.........GCCG-3"; in dergelijke gevallen kunt u nog steeds de laatste primersequentie gebruiken.
Answer
Tenzij u PCRing uitvoert waarvan u weet dat het uitdagend, gebruik gewoon primer3 en maak je er geen zorgen over.