Când este cel mai bine să folosiți Hoechst vs. DAPI pentru colorarea nucleară? Se pare că sunt foarte asemănătoare pe hârtie. Există situații în care cineva este clar preferabil?
Răspuns
Colorantul Hoechst 33342 este similar cu DAPI prin faptul că ambele sunt UV- excitat, minore care leagă canelurile și emit semnale proporționale cu conținutul total de ADN. Ambele sunt excitate maxim în jur de 355 nm și emit în jur de 460 nm. Este necesară o sursă de lumină UV, care poate dăuna celulei. Cu toate acestea, acesta este doar un risc cu Hoechst, deoarece DAPI necesită ca celulele să fie fixate și / sau permeabilizate, ceea ce este incompatibil cu viața. DAPI este mai stabil, dar Hoechst este mai luminos. Ambele sunt supuse albirii foto după expunere îndelungată.
Există un alt colorant ADN mai recent numit DRAQ5 care compensează toate problemele pe care le-am menționat mai devreme – este luminos, destul de stabil pentru fotografii, poate fi folosit în imagistica cu celule vii, iar lungimile sale de undă de excitație și emisie se află în capătul roșu al spectrului, ceea ce înseamnă că nu este nevoie de UV. Am găsit o diagramă comparativă bună la http://www.biostatus.com/product/draq5/live_cell_comparison_chart/ dacă sunteți interesat. Nu am nicio conexiune cu ei, de către într-un fel, tocmai am folosit DRAQ5 mult în trecut.
Comentarii
- Ne pare rău, dar acest răspuns este greșit: majoritatea microscopilor au un Canalul DAPI și atât DAPI, cât și Hoechst pot fi foarte bine utilizate împreună cu coloranți de tip FITC. De asemenea, vă lipsește punctul principal aici: Hoechst poate colora celulele vii, în timp ce DAPI poate ' t. Acesta este principalul motiv pentru care oamenii aleg unul peste altul. -1 nu pentru asta, ci pentru reclama. Nu ' nu cred că acest lucru aparține aici.
- -1: DAPI este absolut compatibil cu GFP, FITC și Alexa 488. \
- rău, editat pentru a reflecta realitatea.
- Folosiți dapi pentru celule fixe, ' este foarte luminos, foarte specific, vă va informa dacă aveți contaminare cu micoplasmă în cultura dvs., are o durată de valabilitate bună și este, în general, destul de ieftin. Dacă trebuie să faceți imagini cu celule vii, folosiți hoechst și, cum ar fi @ user1850479, a declarat că există mai multe tipuri, toate sunt în general mai puțin toxice. Dacă nu poți ' să folosești o coloană nucleară albastră, Draq funcționează bine, ' este puțin slab I ' Am găsit, dar este într-o gamă foarte roșie, este ' relativ relativ / toxic, nu are o durată de valabilitate la fel de bună ca și cealaltă pe care am menționat-o aici, de asemenea ' e foarte scump $$$$$$$ !!!!
Răspunde
DAPI și Hoechst 33342 (există diferiți coloranți Hoechst, 33342 este unul dintre cele mai frecvent utilizate) au caracteristici spectrale foarte similare. Singurul punct este că DAPI este mult mai bine entuziasmat la 405 nm decât Hoechst. Unele microscopii și citometrele de flux au în prezent lasere sau LED-uri de 405 nm în loc de surse UV, deci acest lucru poate deveni relevant.
Principala diferență și principalul motiv pentru a alege unul dintre ele este că Hoechst poate fi folosit pentru a colora celulele vii, deoarece poate trece membrana celulară, în timp ce DAPI nu poate. DAPI necesită celule fixe și permeabilizate.
Comentarii
- Aceasta implică faptul că petele Hoechst sunt mai periculoase pentru cercetător sau mediu? Dacă DAPI poate ' t intră în celule vii, dar Hoechst poate, există îngrijorări cu privire la mutagenitate (similară, de exemplu, cu bromură de etidiu)?
- Da, într-adevăr. Dar tratăm Hoechst și DAPI în același mod în laboratorul nostru.
Răspuns
Îmi dau seama că acesta este un subiect mai vechi, dar aș vrea să clarific câteva concepții greșite:
1) DAPI este denumit de obicei un colorant semi-permanent, deoarece pătrunderea sa prin membranele celulare viabile sunt dependente de concentrație. La concentrații mai scăzute, este în mare parte exclus din celulele viabile, în timp ce la concentrații mai mari, colorează celulele vii și moarte aproximativ în mod egal.
2) Hoechst vine atât în soiuri de membrană permanente, cât și în soiuri impermanente. Asigurați-vă că ați comandat-o pe cea corectă pentru aplicația dvs.!
3) Nu este neapărat adevărat că Hoechst este preferat pentru celulele viabile. Hoechst are o difuzie foarte lentă prin țesut gros, de exemplu, astfel încât pentru aplicații de imagistică in vivo (sau în secțiuni de țesut), DAPI colorează celule viabile mult mai bine decât 33342 (mult mai greu), deoarece este mai capabil să difuzeze prin țesut. Cu toate acestea, pentru celulele izolate, Hoechst 33342 poate colora mult mai rapid nucleele viabile (secunde vs. minute pentru DAPI).