Eu „proiectez un set de grunduri și citesc despre principiile proiectării grundelor, dintre care unul este:
Clemă GC: Prezența bazelor G sau C în ultimele cinci baze de la capătul de 3 „al primerilor (clemă GC) ajută la promovarea legării specifice la capătul de 3” datorită lipirii mai puternice a G și baze C. Mai mult de 3 G „s sau C” ar trebui evitate în ultimele 5 baze la capătul de 3 „al grundului.
De la aici .
Întrebarea mea este cât de esențial este să ai o clemă GC?
Comentarii
- Dacă este important să aveți G sau C de ce ar trebui evitate mai mult de 3 G sau C?
- @biogirl ar trebui evitate mai multe G / C, deoarece în un eveniment de asociere între primeri pe care nu ' nu doriți ca asocierea să fie prea puternică. În caz contrar, ' veți obține o mulțime de dimeri de grund. Ben, prinderea GC este importantă, deoarece va permite o legătură puternică la 3 ' ceea ce este bun pentru alungire, dar acesta nu este parametrul principal care trebuie modificat. Există și alți parametri importanți de gestionat (de exemplu, auto complementaritate, complexitate redusă etc.).
Răspuns
Este greu să oferiți un răspuns obiectiv. Dacă aveți o lungime decentă și o complexitate bună, chiar și un singur terminal 3 „G sau C ar face. Desigur, trebuie să ținem cont de raportul general al divizorului GC:AT și de lucruri precum temperatura de recoacere.
Aici „s un link către diverse opinii despre subiect și are această pepită (la care mă abonez când este posibil):
FWIW, ofertele mele preferate zeilor PCR sunt grunduri cu un singur G sau C 3 „, FWIW. Pare să-i păstreze fericiți pe majoritatea fazelor lunii.
Răspuns
Voi oferi propriul meu cont (empiric) despre proiectarea primerului. O clemă GC ajută la specificitatea amorsării și, prin urmare, contribuie la eficiența generală a reacției PCR. În trecut, am proiectat (din necesitate) grunduri care aveau atât prea multă prindere GC la capătul de 3 „, cât și grunduri utilizate fără prindere GC. Aceste reacții PCR au fost efectuate cu succes, cu niveluri diferite de grund-dimer formare și eficiență generală.
Din experiența mea, prinderea GC este plăcută, dar nu este strict necesară pentru o PCR bună. Regula mea generală este de a termina primerii mei cu 2 G / C ori de câte ori este posibil. Dacă ceva va eșua, de obicei nu este PCR.
Răspuns
GC clamping at 3 „, care are un singur G sau C la capătul de 3 „sau un cuplu de G/C ultimul 6bp la capătul de 3 „al primerului, poate ajuta la reținerea primerului pe șablon în timpul alungirii, datorită lipirii mai puternice în comparație cu A=T. Acest lucru nu este obligatoriu; este unul dintre caracterele primerului care ar putea îmbunătăți reacția PCR.
În același timp, evitați o combinație secvențială de GC în ultimii 6bp ceea ce ar putea duce la auto-dimeri.
Exemplu:
5"-.....GCGC-3" are șanse mai mari de formare a dimerilor decât 5"-.........GCCG-3"; în astfel de cazuri puteți utiliza în continuare ultima secvență primară.
Răspuns
Cu excepția cazului în care sunteți PCRing ceva despre care știți că este provocator, pur și simplu folosiți primer3 și nu vă faceți griji.