När är det bäst att använda Hoechst vs. DAPI för kärnfärgning? De verkar vara väldigt lika på papper. Finns det situationer där man klart föredrar?
Svar
Hoechst 33342-färgämnet liknar DAPI genom att båda är UV- upphetsade, mindre spårbindande och avger signaler som är proportionella mot det totala DNA-innehållet. Båda är maximalt upphetsade runt 355 nm och avger cirka 460 nm. En UV-ljuskälla krävs, vilket kan skada cellen. Detta är dock bara en risk med Hoechst, eftersom DAPI kräver att cellerna fixeras och / eller permeabiliseras, vilket är oförenligt med livet. DAPI är mer stabil, men Hoechst är ljusare. Båda är föremål för fotoblekning efter lång exponering.
Det finns ett annat nyare DNA-färgämne som heter DRAQ5 som kompenserar för alla de frågor som jag nämnde tidigare – det är ljust, ganska fotostabilt, kan användas vid levande cellavbildning, och dess excitations- och emissionsvåglängder ligger i den yttersta röda änden av spektrumet, vilket innebär att ingen UV behövs. Jag hittade ett bra jämförelsediagram på http://www.biostatus.com/product/draq5/live_cell_comparison_chart/ om du är intresserad. Jag har ingen koppling till dem av Jag har precis använt DRAQ5 mycket tidigare.
Kommentarer
- Tyvärr, men det här svaret är fel: De flesta mikroskop har en dedikerad DAPI-kanal och både DAPI och Hoechst kan mycket väl användas tillsammans med FITC-liknande färgämnen. Du saknar också huvudpunkten här: Hoechst kan fläcka levande celler, medan DAPI kan ' t. Det är den främsta anledningen till att människor väljer varandra. -1 inte för det, utan för annonsen. Jag tror inte ' att detta hör hemma här.
- -1: DAPI är helt kompatibelt med GFP, FITC och Alexa 488. \
- min dåliga, redigerad för att återspegla verkligheten.
- Använd dapi för fasta celler, det ' är mycket ljust, mycket specifikt, kommer att meddela dig om du har mycoplasma-kontaminering i din kultur, har en bra hållbarhet och är i allmänhet ganska billigt. Om du måste göra levande cellavbildning använder hoechst och som @ user1850479 uppgav att det finns flera typer, de är i allmänhet mindre giftiga. Om du kan ' inte använder en blå kärnkraftig Draq fungerar bra fungerar det ' en liten dim I ' har hittat men det är i långt rött intervall, det ' är relativt icke / giftigt, har inte så bra hållbarhet som det andra jag nämnde här, också det ' är riktigt dyra $$$$$$$ !!!!
Svar
DAPI och Hoechst 33342 (det finns olika Hoechst-färgämnen, 33342 är en av de mest använda) har mycket liknande spektrala egenskaper. Den enda punkten är att DAPI är mycket bättre upphetsad vid 405 nm än Hoechst. Vissa mikroskop och flödescytometrar har idag 405 nm lasrar eller lysdioder istället för UV-källor, så detta kan bli relevant.
Huvudskillnaden och den främsta anledningen att välja antingen är att Hoechst kan användas för att fläcka levande celler eftersom det kan passera cellmembranet, medan DAPI inte kan” t. DAPI kräver fixerade och permeabiliserade celler.
Kommentarer
- Innebär detta att Hoechst-fläckar är farligare för forskaren eller miljön? Om DAPI kan ' t komma in i levande celler men Hoechst kan, finns det farhågor om mutagenicitet (liknar t.ex. etidiumbromid)?
- Ja, verkligen. Men vi behandlar Hoechst och DAPI på samma sätt i vårt laboratorium.
Svar
Jag inser att det här är ett äldre ämne, men jag vill klargöra vissa missuppfattningar:
1) DAPI kallas vanligtvis ett halvmembran-permanent färgämne på grund av att det tränger igenom Viabla cellmembran är koncentrationsberoende. Vid lägre koncentrationer är det mest uteslutet från livskraftiga celler, medan det vid högre koncentrationer fläckar levande och döda celler ungefär lika.
2) Hoechst finns i både membranpermanenta och permanenta varianter. Se till att du beställer rätt för din ansökan!
3) Det är inte nödvändigtvis sant att Hoechst föredras för livskraftiga celler. Hoechst har till exempel mycket långsam diffusion genom tjock vävnad, så för avbildningsapplikationer in vivo (eller i vävnadsavsnitt), fläckar DAPI ofta livskraftiga celler mycket bättre än (mycket tyngre) 33342 eftersom det är bättre att sprida genom vävnad. För isolerade celler kan dock Hoechst 33342 mycket snabbare fläcka livskraftiga kärnor (sekunder mot minuter för DAPI).