Jag designar en uppsättning primers och läser om principerna för primer design, varav en är:
GC-klämma: Närvaron av G- eller C-baser inom de sista fem baserna från 3 ”-änden av primers (GC-klämma) hjälper till att främja specifik bindning vid 3” -änden på grund av den starkare bindningen av G och C-baser. Mer än 3 G eller C bör undvikas i de sista 5 baserna vid 3 ”-änden av primern.
Från här .
Min fråga är hur viktigt det är att ha en GC-klämma?
Kommentarer
- Om det är viktigt att ha G eller C varför mer än 3 G eller C bör undvikas?
- @biogirl mer G / C bör undvikas eftersom i en händelse där du parar ihop mellan primrarna vill du att ' inte vill att parningen ska vara för stark. Annars får du ' många primerdimerer. Ben, GC-fastspänning är viktigt eftersom det möjliggör stark bindning vid 3 ' vilket är bra för förlängning men detta är inte den primära parametern som ska justeras. Det finns andra viktiga parametrar att hantera (för t.ex. självkomplementaritet, låg komplexitet osv.).
Svar
Det är svårt att ge ett objektivt svar. Om du har en anständig längd och bra komplexitet, till och med en enda terminal 3 ”G eller C skulle göra. Naturligtvis måste man ta hänsyn till primerns totala GC:AT -förhållande och saker som glödgningstemperatur.
Här ”s en länk till olika åsikter om ämnet och den har denna klump (som jag prenumererar på när det är möjligt):
FWIW, mina föredragna erbjudanden till PCR-gudarna är primers med en enda G eller C 3 ”, FWIW. Verkar hålla dem lyckliga i de flesta faser av månen.
Svar
Jag kommer att erbjuda mitt eget (empiriska) redogörelse för grundläggande design. En GC-klämma hjälper till med primingens specificitet och bidrar därför till PCR-reaktionens totala effektivitet. Tidigare har jag (av nödvändighet) designat grundfärger som både hade för mycket GC-fastklämning i 3 ”-änden och använt primers utan någon GC-fastspänning. Dessa PCR-reaktioner utfördes framgångsrikt med olika nivåer av primer-dimer bildning och övergripande effektivitet.
Enligt min erfarenhet är GC-fastklämning trevligt, men inte strikt krävs för god PCR. Min allmänna tumregel är att avsluta mina primers med 2 G / C när det är möjligt. Om något kommer att misslyckas är det vanligtvis inte PCR.
Svar
GC-klämning vid 3 ”, som har en enda G eller C vid 3 ”-änden eller ett par G/C sista 6bp vid 3 ”-änden av primern, kan hjälpa till att behålla primern på mallen under förlängning på grund av starkare bindning jämfört med A=T. Detta är inte obligatoriskt; det är en av tecknen i primern som kan förbättra din PCR-reaktion.
Samtidigt undvik en sekventiell kombination av GC under de senaste 6bp vilket kan leda till självdimerer.
Exempel:
5"-.....GCGC-3" har högre chans för dimerbildning än 5"-.........GCCG-3"; i sådana fall kan du fortfarande använda den senare primersekvensen.
Svar
Om du inte PCRing något du vet är utmanande, använd bara primer3 och oroa dig inte för det.