Hvornår er det bedst at bruge Hoechst vs. DAPI til nuklear farvning? De ser ud til at være meget ens på papir. Er der situationer, hvor man klart foretrækker?
Svar
Hoechst 33342-farvestoffet ligner DAPI, idet begge er UV- ophidset, mindre sporbinding og udsender signaler, der er proportionale med det samlede DNA-indhold. Begge er maksimalt begejstrede omkring 355 nm og udsender omkring 460 nm. Der kræves en UV-lyskilde, som kan skade cellen. Dette er dog kun en risiko med Hoechst, da DAPI kræver, at cellerne er fikserede og / eller permeabiliserede, hvilket er uforeneligt med livet. DAPI er mere stabil, men Hoechst er lysere. Begge er udsat for fotoblegning efter lang eksponering.
Der er et andet nyere DNA-farvestof kaldet DRAQ5, der kompenserer for alle de emner, jeg nævnte tidligere – det er lyst, ret fotostabilt, kan bruges i levende cellebilleddannelse, og dens excitations- og emissionsbølgelængder er i den yderste røde ende af spektret, hvilket betyder, at der ikke er brug for UV. Jeg fandt et godt sammenligningstabel på http://www.biostatus.com/product/draq5/live_cell_comparison_chart/ hvis du er interesseret. Jeg har ingen forbindelse til dem af måde, jeg har lige brugt DRAQ5 meget tidligere.
Kommentarer
- Beklager, men dette svar er forkert: De fleste mikroskoper har en dedikeret DAPI-kanal og både DAPI og Hoechst kan meget vel bruges sammen med FITC-lignende farvestoffer. Du mangler også hovedpunktet her: Hoechst kan plette levende celler, mens DAPI kan ' t. Dette er hovedårsagen til, at folk vælger hinanden frem for hinanden. -1 ikke for det, men for annoncen. Jeg tror ikke ' dette hører hjemme her.
- -1: DAPI er absolut kompatibel med GFP, FITC og Alexa 488. \
- min dårlige, redigeret for at afspejle virkeligheden.
- Brug dapi til faste celler, det ' er meget lyst, meget specifikt, vil fortælle dig, hvis du har mycoplasma-forurening i din kultur, har en god holdbarhed og er generelt ret billig. Hvis du skal udføre live cellebilleddannelse, brug hoechst og som @ user1850479 sagde, at der er flere typer, er de generelt generelt mindre giftige. Hvis du kan ' ikke bruge en blå nukleare stain Draq fungerer godt, er det ' en lille svag I ' har fundet, men det er i langt rødt område, det ' er relativt ikke / giftigt, har ikke så god holdbarhed som det andet jeg nævnte her, også det ' er virkelig dyre $$$$$$$ !!!!
Svar
DAPI og Hoechst 33342 (der er forskellige Hoechst-farvestoffer, 33342 er et af de mest almindeligt anvendte) har meget lignende spektrale egenskaber. Det eneste punkt er, at DAPI er meget bedre begejstret ved 405 nm end Hoechst. Nogle mikroskoper og flowcytometre har i dag 405 nm lasere eller LEDer i stedet for UV-kilder, så dette kan blive relevant.
Hovedforskellen og hovedårsagen til at vælge enten er, at Hoechst kan bruges til at plette levende celler, da det kan passere cellemembranen, mens DAPI ikke kan” t. DAPI kræver faste og permeabiliserede celler.
Kommentarer
- Betyder dette, at Hoechst-pletter er mere farlige for forskeren eller miljøet? Hvis DAPI kan ' t ind i levende celler, men Hoechst kan, er der bekymringer om mutagenicitet (svarende til f.eks. ethidiumbromid)?
- Ja, men vi behandler Hoechst og DAPI på samme måde i vores laboratorium.
Svar
Jeg er klar over, at dette er et ældre emne, men jeg vil gerne afklare nogle misforståelser:
1) DAPI kaldes normalt et semi-membran-permanent farvestof, fordi dets gennemtrængning levedygtige cellemembraner er koncentrationsafhængig. Ved lavere koncentrationer er det for det meste udelukket fra levedygtige celler, mens det ved højere koncentrationer pletter levende og døde celler omtrent ens.
2) Hoechst findes i både membranpermanente og impermanente sorter. Sørg for at bestille den rigtige til din ansøgning!
3) Det er ikke nødvendigvis sandt, at Hoechst foretrækkes for levedygtige celler. Hoechst har for eksempel meget langsom diffusion gennem tykt væv, så til in vivo billeddannelsesapplikationer (eller i vævsafsnit) pletter DAPI ofte levedygtige celler meget bedre end (meget tungere) 33342, fordi det er bedre i stand til at diffundere gennem væv. For isolerede celler kan Hoechst 33342 dog meget hurtigere plette levedygtige kerner (sekunder vs. minutter for DAPI).