Jeg designer et sæt primere og læser om principperne for primer design, hvoraf den ene er:
GC-klemme: Tilstedeværelsen af G- eller C-baser inden for de sidste fem baser fra 3 “-enden af primere (GC-klemme) hjælper med at fremme specifik binding i 3” -enden på grund af den stærkere binding af G og C-baser. Mere end 3 Ger eller Cer bør undgås i de sidste 5 baser i 3 “-enden af primeren.
Fra her .
Mit spørgsmål er, hvor vigtigt det er at have en GC-klemme?
Kommentarer
- Hvis det er vigtigt at have G eller C, hvorfor mere end 3 G eller C skal undgås?
- @biogirl mere G / C bør undgås, fordi i en begivenhed med parring mellem de primere, du ikke ' ikke ønsker, at parringen skal være for stærk. Ellers får du ' mange primerdimerer. Ben, GC-fastspænding er vigtig, da det tillader stærk binding ved 3 ', hvilket er godt til forlængelse, men dette er ikke den primære parameter, der skal justeres. Der er andre vigtige parametre at håndtere (f.eks. Selvkomplementaritet, lav kompleksitet osv.).
Svar
Det er svært at give et objektivt svar. Hvis du har en anstændig længde og god kompleksitet, er selv en enkelt terminal 3 “G eller C ville gøre. Selvfølgelig skal man tage højde for primerens samlede GC:AT -forhold og ting som udglødningstemperatur.
Her “s et link til forskellige meninger om emnet, og det har denne nugget (som jeg abonnerer på, når det er muligt):
FWIW, mine foretrukne tilbud til PCR-guderne er primere med en enkelt G eller C 3 “, FWIW. Synes at holde dem glad for de fleste faser af månen.
Svar
Jeg vil tilbyde min egen (empiriske) redegørelse for primer-design. En GC-klemme hjælper med primingens specificitet og bidrager derfor til den samlede effektivitet af PCR-reaktionen. Tidligere har jeg (af nødvendighed) designet primere, der både havde for meget GC-fastspænding i 3 “enden og brugt primere uden GC-fastspænding. Disse PCR-reaktioner blev udført med succes med forskellige niveauer af primer-dimer dannelse og samlet effektivitet.
Efter min erfaring er GC-fastspænding pæn, men ikke strengt krævet for god PCR. Min generelle tommelfingerregel er at afslutte mine primere med 2 G / C, hvor det er muligt. Hvis noget kommer til at mislykkes, er det normalt ikke PCR.
Svar
GC-fastspænding ved 3 “, der har et enkelt G eller C i 3 “-enden eller et par G/C inden for sidste 6bp ved 3 “ende af primer, kan hjælpe med at fastholde primeren på skabelonen under forlængelse på grund af stærkere binding sammenlignet med A=T. Dette er ikke obligatorisk; det er et af tegnene i primeren, der kan forbedre din PCR-reaktion.
På samme tid skal du undgå en sekventiel kombination af GC i de sidste 6bp hvilket kan føre til selvdimerer.
Eksempel:
5"-.....GCGC-3" har større chance for dannelse af dimer end 5"-.........GCCG-3"; i sådanne tilfælde kan du stadig bruge den sidstnævnte primersekvens.
Svar
Medmindre du PCRing noget, du ved at være udfordrende, brug bare primer3 og bekymre dig ikke om det.