Alapozó készletet tervezek, és olvasok az alapozó tervezés alapelveiről, amelyek közül az egyik a következő:
GC Clamp: A G vagy C bázisok jelenléte az alapozók 3 “végétől számított utolsó öt bázisban (GC clamp) elősegíti a specifikus kötődést a 3” végén, a G erősebb kötése miatt és C bázisok. Az alapozó 3 “végén az utolsó 5 bázisban több mint 3 G” vagy C “kerülendő.
ide .
A kérdésem az, hogy mennyire elengedhetetlen a GC bilincs?
Megjegyzések
- Ha fontos, hogy G vagy C legyen, miért kell kerülni több mint 3 G vagy C értéket?
- @biogirl több G / C-t kerülni kell, mert a primerek közötti párosítási esemény, amelyet nem akarsz ' akarni, hogy a párosítás túl erős legyen. Ellenkező esetben ' sok primer dimert kap. Ben, a GC rögzítése fontos, mivel lehetővé teszi az erős kötést a 3 ' nél, ami jó a megnyúlásnak, de ez nem az elsődleges paraméter, amelyet módosítani kell. Más fontos paraméterek is kezelhetők (pl. Önkiegészítés, alacsony komplexitás stb.).
Válasz
Nehéz objektív választ adni. Ha megfelelő hosszúságú és jó komplexitás van, akkor akár egyetlen 3-as terminál “” G vagy C megtenné. Természetesen figyelembe kell venni az alapozó általános GC:AT arányát és az izzítási hőmérsékletet.
Itt “s link a témával kapcsolatos különféle véleményekre , és rendelkezik ezzel a rögvel (amire lehetőség szerint feliratkozom):
FWIW, a PCR-istenekkel szemben az én ajánlataim az egyetlen G vagy C 3 “, FWIW primerek. Úgy tűnik, hogy” a hold legtöbb fázisát boldoggá teszik.
Válasz
Felajánlom saját (empirikus) beszámolómat az alapozó tervezéséről. A GC-szorító segíti az alapozás specifikusságát, és így hozzájárul a PCR reakció általános hatékonyságához. Korábban (szükségből) olyan primereket terveztem, amelyek túl sok GC-szorítóval rendelkeztek a 3 “-os végén, és primereket használtam GC-szorítás nélkül. Ezeket a PCR-reakciókat sikeresen hajtottuk végre, különböző primer-dimer szintekkel kialakulása és általános hatékonysága.
Tapasztalataim szerint a GC-befogás szép, de a jó PCR-hez nem feltétlenül szükséges. Általános elvem az a szabály, hogy az alapozókat 2 G / C-val fejezzem be, ahol csak lehetséges. Ha valami nem fog sikerülni, akkor általában nem a PCR.
Válasz
GC szorítás 3 “-nál van az, hogy egyetlen G vagy C a 3 “végén, vagy pár G/C a az utolsó 6 bp az alapozó 3 “végén, segíthet az alapozó megtartásában a sablonon a megnyúlás során, az erősebb kötés miatt a A=T -hez képest. Ez nem kötelező; ez az alapozó egyik karaktere, amely javíthatja a PCR reakciót.
Ugyanakkor kerülje a GC szekvenciális kombinációját az utolsó 6 bp-ben ami öndimenziókhoz vezethet.
Példa:
5"-.....GCGC-3" nagyobb esélye van a dimer képződésének, mint a 5"-.........GCCG-3"; ilyen esetekben továbbra is használhatja az utóbbi primer szekvenciát.
Válasz
Hacsak nem PCR-t csinál, amit tud kihívást jelent, csak használja a primer3-at, és ne aggódjon miatta.